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吸附层析是最早使用的一种层析方法,其基本原理是依据不同物质在同一吸附剂上的吸附能力的不同来进行分离。这种吸附作用的本质多为基质和样品间的非专一偶极与偶极间的作用。将样品放入层析基质后,经展开,吸附能力差的蛋白质迁移得快,而吸附能力强的蛋白质移动得慢,从而可使一个混合物中的几种蛋白质按其吸附性的差异被彼此分开。常用的吸附剂有硅胶和磷酸钙凝胶等。
吸附层析可以是薄层层析,也可以是柱层析——即蛋白纯化系统使用的纯化方式。硅胶通常用于薄层层析——将不同颗粒度的硅胶用水调成糊状铺于玻璃板上,后经高温烘干。硅胶也可用于柱层析。硅胶主要是用于疏水性物质的分离,在蛋白质化学中不常使用,但可以用于小分子多肽的分离和分析。磷酸钙凝胶与硅胶相反,基本上只用于柱层析,主要用于蛋白质等大分子的分离,对某些酶类的分离呈现很好的效果。
吸附层析常用于浓缩样品。一些浓度很稀的样品,在特定的条件下吸附在层析柱上,而后突然地改变条件,将被吸附的样品一起从吸附柱上洗脱下来,这样所得的样品的浓度可以提高很多。
离子交换层析
这是蛋白纯化系统使用的最广泛的层析之一,原理是利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用达到分离纯化的目的,其本质也可归纳为吸附层析,只是吸附作用来自离子间的静电作用。离子交换层析所用的基质被称为离子交换树脂。根据所用树脂的电荷性质,这类层析又可以分为阳离子交换层析和阴离子交换层析。根据树脂上可电离基团的解离度,它们又可分为强和弱的离子交换树脂。通常吸附在强离子交换树脂上的物质要用较强的酸或碱洗脱,而多数蛋白质对酸碱不太稳定,所以对于蛋白质较多使用弱离子交换树脂。一些较小且较稳定的分子,如氨基酸和小分子多肽等,仍可用强离子交换树脂。另外,在测定结构时,无需考虑活性,则可任意选用,达到分离的目的即可。
用离子交换树脂进行生物分子分离时,pH是很重要的因素。对蛋白质或多肽类两性电解质而言,处于不同的pH, 所带的电荷不同。于是,在不同的 pH 和不同的离子强度下,蛋白质或多肽在不同的离子交换树脂上的吸附程度也不同。如果能选择适当的条件,会对蛋白质的分离纯化起到事半功倍的效果。以免疫球蛋白G (lgG) 的分离纯化为例, 它的等电点较高,故在较高pH和较低离子强度时,不能吸附在阴离子交换树脂上。用硫酸铵分级沉淀后,收集0~40%饱和度的沉淀,用pH= 8 左右的缓冲液(含约50mmol/L的NaCI) 溶解并透析,然后再用同样缓冲液平衡的DEAE 离子交换树脂,结果只有IgG没有吸附,其他的蛋白质几乎全吸附在柱上。
离子交换层析基本上是用于亲水物质的分离,其选用的树脂类型以及样品洗脱的条件可以对样品的带电行为提供一些信息。离子交换树脂价格相对低廉,因此广泛用于蛋白质等生物活性物质的制备。
另外,有层析聚焦技术(chromatofocusing) ,此类特殊的离子交换树脂商品名为聚缓冲液交换剂(poly buffer exchanger)。先用某一pH缓冲液平衡聚缓冲液交换剂,再用另一pH缓冲液平衡,就能在这种离子交换剂上建立一个pH 梯度。上样以后,用一种具有pH 梯度的聚缓冲液洗脱树脂时,被吸附样品中的蛋白质就能按照它们的等电点依次被洗脱。在这一过程中同时产生聚焦作用,致使各蛋白质分级变得很窄,样品高度浓缩,整个分离过程呈现出很高的分辨率。
根据离子交换层析的原理,出现了另一些交换层析,例如巯基交换层析。制备一种以活化巯基或游离巯基为配基的固定相,作为配基的活化巯基或游离巯基就可以与含有游离巯基的蛋白质发生反应,结合在层析柱上,其他没有游离巯基的分子就很容易被除去。最后再用适当的条件断裂配基和分子间的二硫键,就能洗脱并回收到具有游离巯基的蛋白质。这个例子说明可以从离子交换层析中的非共价键扩展到巯基交换层析中的共价键。有机汞也可专一地与巯基化合物反应,为此以有机汞化物为配体的基质也可有效地分离含有游离巯基的蛋白质分子。
亲和层析
这是一种以样品生物活性为依据的分离分析方法。生物分子的特点是有其专一的活性:例如酶分子与底物或抑制剂的专一结合;抗原和抗体的结合;激素与其受体的结合;一些维生素和血浆中的运载蛋白质的结合;凝集素与糖类的结合;核酸和有关蛋白的结合等。如果能将上述例子中的诸多相互作用体系中的一方连接到基质上使之固定化,就有可能分离纯化专一作用的另一方。如果将生物分子间的互补作用视为特殊的吸附作用,亲和层析也能归类到吸附层析中。
为了能有效地进行分离分析,在将配体和基质连接时一定要保留配基的生物活性,即连接方法不能过分剧烈。同理,在样品被亲和在固定化配基后,所用的解吸条件也应尽可能温和,以免样品或固定化配体失活。
亲和层析最大的特点是高效和简便,一旦固定化配体制备后,操作使用非常方便。通常只要在上样后洗去杂质,就可将所要的物质解吸下来,且所得物质已有较高的纯度。此方法可以从含量极低的原料中经一次亲和层析分离出所要的物质,产率也较高。亲和层析的过程也是高度浓缩的过程。亲和层析还有另外两个优点是其他的分离纯化方法所不能相比的:一、可以从样品中除去大量的杂质,产率较高地得到少量的物质;二、可以在活性物质中除去理化性质几乎完全相同的失活杂质,这对提高酶或其他分子的比活特别有用。
亲和层析中有三种具有较大通用性的技术:免疫亲和层析、凝集素亲和层析和染料亲和层析。用蛋白质抗体耦联到载体所形成的免疫亲和柱可用于抗原蛋白的分离和纯化。凝集素是一大类能专一与糖类及糖复合物结合的蛋白质,固定化的凝集素则可用于糖蛋白的分离纯化。
疏水层析
生物体内存在大量的水,因此生物分子几乎都同时具有亲水和疏水两重性。如果基质上接有疏水的基团,就可能在一定条件下和某些生物分子中的疏水部位相互作用,从而达到分离和纯化的目的。一般情况下,高盐浓度使疏水物质吸附,降低盐浓度则使疏水柱上吸着的样品解离。除了盐浓度,pH、温度和去垢剂等也能对疏水层析起作用。
疏水配体的种类很多,可以是直链的烷基也可以是芳香族的苯环。目前广泛使用的反相高效液相色谱柱,例如C-8和C-18等,从本质来看均属于疏水层析的类型。
鳌合层析
在生物分子中亲水的部位也经常可以彼此形成氢键和其他配位键,鳌合层析就是基于这个原理。在一些基质上接有亚氨基二乙酸等具有配位能力的分子,这样的介质就能螯合锌、铜、铁等离子,而这些离子的配位价还未饱和,为此离子还可以与蛋白质等生物分子形成配位键。不同生物分子形成的配位键的强度各异,从而可起到分离纯化作用。这类层析不仅可以分离纯化转铁蛋白和铜盐蛋白等含有金属的蛋白质,也可分离不含金属的蛋白,例如a2 -巨球蛋白。
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