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利用溶解度差别实现蛋白纯化分离的方法

蛋白质在水中的溶解度及其稳定程度取决于蛋白质分子的解离状况、离子基团带电荷的性质及其水合程度。能够影响蛋白质分子的带电性质和水合程度的因素,都能改变其溶解度。

溶液pH的影响

蛋白质分子是两性电解质,在不同的pH中,各解离团解离的程度不同,可能显示带正电、负电或电中性的状况。当溶液的pH与蛋白质的等电点(PI)相同时,蛋白质分子呈现出电中性,分子间无排斥力,易于积聚和沉淀,此时蛋白质的溶解度小;溶液的pH高于等电点时蛋白质分子带负电,反之则带正电。带同种电荷的蛋白质分子间存在排斥力,不易积聚和沉淀。因此,溶液的pH可以通过影响蛋白质分子的带电状况而改变其溶解度。

不同的蛋白质由不同的氨基酸组成,因此其等电点也不同。利用蛋白质的这一特性,可以通过改变溶液的pH,使要分离的蛋白质大部或全部沉淀下来,而其他蛋白质仍留在溶液中,以达到粗分蛋白质组分的目的。这样蛋白纯化分离方法获得的蛋白质仍能保持其生物学活性。

某些蛋白质沉淀剂的作用

某些离子型的表面活性剂,可以通过改变蛋白质的带电性质使其沉淀下来,如:鱼精蛋白、硫酸链霉素、丹宁酸等多价阳离子物质,能中和蛋白质分子上大部分的阴离子,并和蛋白质形成复合物而共同沉淀下来。

某些水溶性的非离子型聚合物也可以使蛋白质沉淀。这类物质包括葡聚糖硫酸钠、聚乙二醇(PEG)等,其原理尚不明确。

溶液中盐离子浓度的影响

盐离子对蛋白质溶解度的影响随其浓度不同而不同。在低盐浓度的蛋白质溶液中,由于静电作用,蛋白质分子外围聚集了带相反电荷的离子,从而加强了蛋白质和水的作用,减弱了蛋白质分子间的作用力,于是增加了蛋白质的溶解度。这种因加入中性盐而使蛋白质溶解度增加的现象称为盐溶作用。但随着盐浓度增加,盐离子可与蛋白质离子竞争溶液中的水分子,从而降低了蛋白质分子的水合程度。失去水化层的蛋白质分子易于积聚而沉淀,此现象称为盐析。不同的蛋白质分子发生盐析所要求的盐离子的浓度不同,因此可以通过在蛋白质溶液中加入不同量的中性盐使目标蛋白质与杂质分离。

实际操作过程中,可以试用硫酸铵分级沉淀法,以确定目标蛋白质存在于硫酸铵的哪个百分比浓度段。先用某段的低盐浓度将先行沉淀的杂蛋白去掉,再将盐浓度调到该段高浓度处,使目标蛋白质沉淀出来。和目标蛋白质一起盐析出来的中性盐可以用透析或凝胶过滤的方法除去。

溶剂极性的影响

溶剂的极性对蛋白质溶解度的影响包含两方面:一、加入能与水混溶的有机溶剂,从而使蛋白质脱水;二、有机溶剂的加入降低了溶液的介电常数,在低介电常数环境中,增强了蛋白质分子间的作用力,从而使蛋白质分子易于凝集沉淀。用此方法粗提蛋白质时应注意控制温度,温度较高时蛋白质分子易变性。

温度的影响

温度对蛋白质溶解度的影响,根据蛋白质分子种类的不同而不同。一般情况下,蛋白质的溶解度随温度的升高而增加。但是当温度升高到一定程度时,温度可能导致蛋白质的热变性。变性的蛋白质溶解度变小并凝集沉淀。所以除耐热蛋白质可在常温下分离纯化以外,绝大多数蛋白质的分离纯化均应在4℃左右进行。

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